Novo Telecurso, aula número 49 sobre Biologia (técnica do PRC)

http://www.youtube.com/watch?v=wIKjyBG3HwY/  (Parte 1)
http://www.youtube.com/watch?v=UrRrD4YzmG4    (Parte 2)

PCR - Amplificação de DNA in vitro Básico

Fundamentos da Técnica de PCR

Em 1993, Kary Mullis, um geneticista ao serviço da Cetus, uma empresa de Biotecnologia da Califórnia, recebeu o prémio Nobel da Química pelo desenvolvimento de um método que permite sintetizar, em poucas horas e in vitro, uma grande quantidade de um determinado fragmento de DNA. Esta técnica faz parte integrante da moderna biotecnologia molecular, tendo trazido um enorme progresso a áreas como o diagnóstico de doenças, medicina forense entre muitas outras para além da Investigação em Biologia.
A técnica de PCR (polymerase chain reaction - reacção em cadeia pela polimerase) baseia-se no processo de replicação de DNA que ocorre in vivo . Durante o PCR são usadas elevadas temperaturas de forma a separar as moléculas de DNA em duas cadeias simples, permitindo então a ligação de oligonucleótidos iniciadores (primers), também em cadeia simples e geralmente constituídos por 15 a 30 nucleótidos, obtidos por síntese química. Para amplificar uma determinada região são necessários dois iniciadores complementares das sequências que flanqueiam o fragmento de DNA a amplificar, nos seus terminais 3', de modo a permitir a actuação da DNA polimerase durante a síntese da cadeia complementar, usando como molde cada uma das duas cadeias simples constituintes do DNA a amplificar (figura 1).

Para realizar PCR são necessárias pequenas quantidades do DNA alvo, um tampão salino contendo a polimerase, oligonucleótidos iniciadores, os quatro desoxinucleótidos constituintes do DNA e o cofactor Mg²⁺. Esta mistura é submetida a vários ciclos de amplificação que consistem em:

• Desnaturação do DNA alvo pelo calor (tipicamente 1 minuto a 94-96ºC), de modo a separar as duas cadeias
• Associação dos iniciadores por ligações de hidrogénio ao DNA alvo em cadeia simples. Para permitir essa associação, a mistura de reacção é arrefecida (tipicamente a temperaturas entre 50 e 65ºC, durante 1 minuto; a temperatura a usar depende da % GC da sequência a amplificar)
• Extensão dos iniciadores através da síntese da cadeia complementar de cada cadeia molde, catalisada pela DNA polimerase (tipicamente 1 minuto a 72ºC)

O processo envolvendo estes três passos, pode ser repetido várias vezes (25 a 30 ciclos) sendo possível aumentar, em cada ciclo, duas vezes a concentração de DNA pré-existente (figura 2). Em teoria, se for possível levar a cabo 25 ciclos de amplificação seguidos, a concentração de DNA aumentaria 2²⁵ vezes embora, na prática, devido a alguma ineficiência no processo de amplificação, esse aumento fique por um milhão de vezes.

Como na técnica de PCR se encontram envolvidos vários ciclos de amplificação, foi desenvolvido equipamento que permite programar, de forma contínua e automatizada, os vários ciclos de aquecimento e arrefecimento. Para tal ser concretizável, as DNA polimerases utilizadas deverão ser termoestáveis, tendo tal sido conseguido com o isolamento da DNA polimerase da estirpe termofílica Thermus aquaticus (Taq DNA polimerase) que actua a temperaturas elevadas levando assim a um aumento da especificidade da reacção. De referir ainda que o produto de PCR pode ser visualizado após electroforese em gel de agarose e o seu tamanho ser estimado por comparação com padrões lineares de DNA.

Biologia é a ciência que estuda os seres vivos. Debruça-se sobre o funcionamento dinâmico dos organismos desde uma escala molecular subcelular até o nível populacional e interacional, tanto intraespecíficamente quanto interespecíficamente, bem como a interação da vida com seu ambiente físico-químico. O estudo destas dinâmicas ao longo do tempo é chamado, de forma geral, de biologia evolutiva e contempla o estudo da origem das espécies e populações, bem como das unidades hereditárias mendelianas, os genes. A biologia abrange um espectro amplo de áreas acadêmicas frequentemente consideradas disciplinas independentes, mas que, no seu conjunto, estudam a vida nas mais variadas escalas.

A vida é estudada à escala atômica e molecular pela biologia molecular, pela bioquímica e pela genética molecular, no que se refere à célula pela biologia celular e à escala multicelular pela fisiologia, pela anatomia e pela histologia. A biologia do desenvolvimento estuda a vida ao nível do desenvolvimento ou ontogenia do organismo individual.

Subindo na escala para grupos de mais que um organismo, a genética estuda as bases da hereditariedade e da variação entre indivíduos. A etologia estuda o comportamento dos indivíduos. A genética populacional estuda a dinâmica dos alelos nas população, enquanto que a sistemática trabalha com linhagens de muitas espécies. As ligações de indivíduos, populações e espécies entre si e com os seus habitats são estudadas pela ecologia e as origens de tais interações pela biologia evolutiva. Uma nova área, altamente especulativa, a astrobiologia (ou xenobiologia ou ainda exobiologia) estuda a possibilidade de vida para lá do nosso planeta. A biologia clínica constitui a área especializada da biologia profissional, para Diagnose em saúde e qualidade de vida, dos processos orgânicos eticamente consagrados.

Os ramos da Biologia são:

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• Bacteriologia
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• Citologia ou Biologia Celular                                            
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